《科學大家》專欄|鎖定"毒源"的利器:基因組時代的病原檢測技術
2021年01月08日09:18

  出品:新浪科技《科學大家》、未來論壇

  主講嘉賓:王健偉,中國醫學科學院-北京協和醫學院副院校長

  經過一整年嚴格的新冠疫情防控,時間再次帶著我們進入嚴冬,全國多個城市又出現了小範圍疫情。與去年此時不同的是,我們已經掌握了更多的防控信息和技術,也有了一套較為成熟的應對方案,包括北京、大連、瀋陽等城市在內,各地均能夠在發現疫情後短時間內完成流調排查,為數千萬市民進行病毒核酸檢測。

  新型冠狀病毒的全球大流行是很多人第一次親身經曆重大疫情。其實自人類文明誕生以來,傳染病就如影隨形,和人類相伴。人類歷史上數次爆發重大疫情,瘟疫造成的死亡數量堪比戰爭。傳染病不僅危害人類的健康,還對政治、經濟、社會、軍事產生重要的影響。從希臘文明的隕落到基督教的興起,從阿茲特克帝國的衰亡到第一次世界大戰的終戰,其間都有傳染病的身影。

  儘管隨著現代醫學的發展,傳染病的發病率和病死率有了顯著的下降,但仍然是人類的重大挑戰。比爾蓋茨在2015年的一次演講時說道:“在未來幾十年,如果說有什麼東西能夠殺死上千萬人,最有可能是一種高度傳染性的病毒。”鑒於此,世界衛生組織號召全世界加強對傳染病的研究,以應對可能出現的暴發流行。嚴格準確的病原檢測技術,正是重要的應對手段之一。檢測技術如何幫助防疫人員們變身“福爾摩斯”?病毒溯源的過程又是什麼樣的?

  未雨綢繆的前瞻性研究

  從2015年開始,世界衛生組織每年都列出號召全球優先研究的傳染病清單。從2018年開始,“X疾病”一次開始出現在這份清單中。“X疾病”代表一種未知病原體造成的嚴重的流行病,可以是自然發生的,也可以是人為故意的,有可能在任何的時間,由多種來源觸發,或許會奪去數百萬人的生命。這種“X疾病”代表了未來的一種可能——可能是一種未知的傳染病。

  目前,已經知道的病毒有很多。據科學家估計,在哺乳動物和鳥類當中有100多萬種病毒,而其中至少有60萬種以上可以感染人類。但目前已知可感染人類的病毒還不到300種,“儘管大家知道病毒是潛在的威脅,但依然無法預測下一種新的病毒在何時何地出現,或者來自哪一種物種。”因此,加強病原檢測鑒定技術以及藥物疫苗的研究,是應對未來可能出現的新發突發傳染病挑戰的一項重要舉措,這其中病原檢測技術又首當其衝。

  目前病原的檢測技術面臨著眾多的挑戰。一是病原的種類非常多。目前可以引起傳染病的病原包括病毒、細菌、真菌、寄生蟲等很多種類。二是病原體的變異非常頻繁,可以通過突變來逃逸免疫,引起新的流行,也可以逃避原有疫苗的作用。動物來源的病原識別也比較困難。三是可能存在著多種病原體共感染的現象,為病原的鑒定帶來了困難。此外,臨床樣本中病原的含量可能比較低,檢測也比較困難。

  近百年以來,隨著微生物學的發展,對病原體的檢測已經建立了多種方法。以病毒檢測為例,我們可以檢測分離的整體病毒顆粒,也可以對其抗原成份進行檢測,還可以檢測病毒感染人體產生的抗體,對病毒的感染進行診斷。另外,隨著分子生物學技術的興起,核酸檢測成為代表性的技術方法。這些技術的用途比較廣泛,但是還存在一些不足。比如病毒顆粒分離培養的方法,它的技術難度比較大、比較耗時,檢出率低,難以普及。抗原抗體的檢測方法容易受到干擾,抗體的檢測存在窗口期的問題,抗原的檢測存在靈敏度的問題。

  核酸檢測是目前應用比較廣泛的,最具代表性的是PCR方法。這種方法通過對一個病毒的基因片段進行上億次的擴增,使痕量的病毒核酸得以檢測,所以在臨床上得到了比較多的應用。但PCR的方法受製於對病毒序列的依賴,即必須先要知道病毒的基因序列才能設計出PCR的檢測方法。

  “一錘定音”:宏□因組測序技術

  近年來,高通量的宏□因組測序技術逐漸得到了應用,並且發揮了重要的作用,特別是在病原體的診斷當中,發揮“一錘定音”的作用。宏□因組技術用於病原體的檢測有很多的優勢。一是和PCR這些序列依賴的方法相比,它是非序列依賴性的,所以不需要預知任何病原體序列信息就可以進行檢測。二是病原體檢測的靈敏度比較高。三是檢測的通量高,可以同時檢測上萬種病原微生物的物種,也可以發現可能的共感染。四是檢測效能高,通過一次測序就可以拚接出病原體的基因組序列,不需要再重複進行實驗。五是解析的深度深,可以同時分析病原體的變異和耐藥等情況。最後,它獲取的信息全,除了獲取病原的序列之外,還可以同時獲取宿主的基因組和轉錄組的信息,為預警和臨床診療提供基礎。

  宏□因組的病原體檢測技術在近十幾年以來,在新病原的發現當中發揮了重要的作用。首先就是新冠病毒的發現和確症。2019年12月,武漢出現了不明原因的肺炎。由於偶然的機會,我們的合作夥伴對來自武漢的一例不明原因肺炎的肺泡灌洗液的樣本進行了深入的測序,對這個數據分析後我們發現裡面存在著一種新的冠狀病毒,並且拚接出了它的全基因組序列。這個序列顯示,它和既有的SARS病毒和MERS病毒(中東呼吸綜合症冠狀病毒),序列是完全不同的。這說明存在一種全新的冠狀病毒,可能和出現的肺炎病例有關係。

  接下來要做的是確證是不是這一新的冠狀病毒引起了這些肺炎的病例。所以我們從病人身上收集了更多肺泡灌洗液、咽拭子、痰液等樣本,把呼吸道樣本進行前處理,提取核酸之後來建立測序文庫。對樣本上機測序之後進行生物信息學的分析,首先去除人類基因組的汙染,把賸餘的序列和公開的數據進行比對,鑒別裡面存在的微生物的物種,從而確定病原。

  但是對於新病原的鑒定來講,光靠測序還不夠,還需要用其他的方法進行鑒定。我們首先對5例樣本進行檢測。可以看到,5個病例的呼吸道樣本當中都可以檢測出一種新的冠狀病毒的基因。對它進行基因譜系的分析,就像畫家譜一樣的,和其他已經知道的冠狀病毒去比較發現,發現這個冠狀病毒是一個全新的病毒。而且我們也推測,它和SRAS病毒相似,也可能使用ACE2作為受體。

  在這個基礎上,我們很快分離出了病毒,通過電子顯微鏡可以看出,它是典型的冠狀病毒的形態,上面有像皇冠一樣的特徵性結構。另外,我們也做了免疫學的實驗。因為病人感染病毒之後會產生抗體,我們利用這些抗體與分離的病毒做免疫螢光可以看到陽性的信號。所以結合我們的宏□因組的分析、PCR的檢測、病毒的分離、免疫螢光的鑒定等等,提示這是一種新的冠狀病毒,引起了不明原因的肺炎。

  因為有了這樣的方法,我們和曹彬教授、黃朝林教授等合作,很快對早期的病例進行診斷,使我們能夠很快報導這些病例的臨床特徵,而且也對這些病例的來源進行了追溯,為疫情的預警和臨床診療方案的製定提供了重要的基礎。我們也通過GISAID的平台,代表國家最早向全球共享了病毒全基因組的序列。病原鑒定工作得到了世界衛生組織的高度評價,譚德賽總幹事指出:“中國在創記錄的時間內識別出病原體,並立即進行分享,為迅速研發診斷工具作出了貢獻。”

  在這個基礎上,我們也研發了病毒核酸的檢測方法,向全國推廣應用。2020年1月11日,這一方法在武漢現場通過了國家衛生健康委科教司組織的驗證,之後獲得了產品證書。

  另外,針對PCR檢測方法對咽拭子檢出率不到50%的情況,我們也提出結合IgM抗體的檢測,可以大幅提升病毒感染的診斷率,我們也獲得了兩項診斷產品的證書。

  準確追蹤疫情的重要工具

  在去年三四月後全國的疫情逐漸歸於穩定平靜。北京在6月10日之前已經有連續56天沒有本地新發的新冠肺炎病例。6月11日卻突然發現一個病例,引出了新一波小範圍疫情。這次疫情通過全市的篩查和防控措施的實施等一系列的努力,到8月初被成功終止,有力地維護了首都的安全。但是在疫情應對的過程中,有這樣幾個為題需要準確回答:疫情是什麼時候發生的,是從哪兒來的,源頭在哪裡,是怎麼傳播的等等,這樣才能為此後防控提供有效的指導。

  6月11日的病例發現以後,通過對患者軌跡的追溯,北京有關部門對他的密切接觸者和接觸的環境樣本進行了檢測。由此發現了兩份來自新發地農貿市場的樣本是新冠病毒的核酸檢測陽性。在這個基礎上,對新發地進行了擴大檢測,在538份樣本當中檢測出45份是陽性。這說明新發地是疫情發生過程中的重點場所。因此,北京市有關部門在6月13日果斷的關閉了新發地市場。市場關閉以後,在全市採取了嚴格的管控措施,病例的數量迅速下降,到7月初,基本上沒有新發的病例,疫情得到了有效的控制。

  新發地是北京最大的農貿市場,有超過5千以上的攤位,每天的客流量有5萬以上,所以它的疫情備受重視。北京市有關部門對新發地的員工進行了篩查,發現在3300多位員工當中有169位是新冠病毒核酸陽性。

  與此同時,流調結果顯示,在關閉市場之前,從5月底到關閉市場之前的10多天中,有55萬顧客到訪過新發地。通過對他們的追蹤,發現有103例是新冠病毒陽性。在這個基礎上,對全市1000萬人進行了篩查,發現96人是陽性。截止到7月10日,總共發現了368名感染者,距離6月11日發現病例剛好過去了一個月的時間。

  確定感染路徑之後就有這麼幾個問題需要解答。首先,病毒是什麼時候進入新發地市場的?我們將所有的病例做了一個時間的分佈。由於新冠病毒感染的潛伏期一般在14天以內,所以從6月初的病例往前推,應該病毒是在5月底侵入到了市場中。不論是員工、顧客,還是沒有市場接觸史的感染者,他們基本上都和新發地有直接或間接的關係,所以新發地是這次疫情唯一的來源。

  確定了新發地是疫情的來源,那麼它的源頭又在哪裡?北京市有關部門對新發地內環境樣本和從業人員進行了檢測,包括交易大廳的負一層,檢測了584個人,其中有122人是陽性,陽性率高達20.9%。市場上的其他廳檢測了2727人,47人陽性,陽性率只有1.7%。所以交易大廳引起了高度的關注。交易大廳分為海鮮區、展櫃區、豆製品區和牛羊肉區,其中海鮮區的檢出率最高,高達50%以上。

  攤位的環境樣本和人員樣本的監測結果還顯示,有14個攤位的工作人員和環境樣本都是陽性的。因為北京當時沒有疫情傳入,而且在這之前也沒有發現感染者,所以病毒極有可能是從新發地的環境當中來的,所以這14個攤位被列為重點研究對象。對5月下旬到6月12日之前到訪的這14個攤位的3200多名顧客進行了抗體的檢測後,我們發現有5位顧客的抗體是陽性的,而恰好這5位顧客在5月30日和31日都到訪過S14這個攤位,而且這5個人和他的密切接觸者,在14天內都沒有到訪過其他的中高風險地區,也沒有接觸過來自中高風險地區的人員,基本可以排除是外來的感染。

  在此基礎上,對這些病例到訪的攤位進行了研究,顯示S14攤位感染的比例是最高的,7個員工全部都感染了,而且抗體的陽性率也是最高的。另外,從發病的時間來看,他們的發病時間在發病的感染者當中也是比較早的。這個攤位的所有工作人員14天以內都沒有到訪過其他的中高風險地區,也沒有接觸過來自中高風險地區的人員。據此可以判斷,S14攤位很可能就是感染的源頭。

  形成檢測技術體系,更快更便宜更智能

  鎖定了S14攤位,且可能是環境樣本造成暴露,那麼病毒又是從哪兒來的呢?結合流行病學和測序技術的基因組流行病學,是追蹤傳染的來源的一個非常有用的工具。但在環境樣本中,病毒的含量是特別低的,樣本量又非常大,通過高通量測序有一定困難。在北京大學謝曉亮教授的支援下,清華大學王建教授的團隊開發了一種基於SHERRY的Minerva技術。通過這個技術可以把文庫構建的速度縮短到5個小時以內,測序的速度更加快捷;另外,還能建立了基因組富集的方法,使載量很低的樣本能夠得到有效測序。

  基於這樣一個技術體系,我們通過合作,對110份新冠病毒陽性的感染者和環境樣本進行了病毒基因組測序,得到了72條高質量的全基因組序列,包括56條感染者的基因組序列和16條環境樣本的基因組序列。通過這樣的方法我們也得到了環境樣本的全序列。對這個序列進行分析發現,每一條序列上都有8個突變的位點,有53%的序列只有這8個突變,其餘的序列還有其他一些突變。這就說明這些突變是單一的來源,從病毒基因組的層面也證明新發地的感染是單一來源的。

  這個過程是對病毒進化樹分析的前提,之後的工作就像我們排家譜一樣,看看那些病毒系列的相似度更高。新發地發生疫情時,在吉林和黑龍江也有疫情,比對後我們發現,來自北京新發地的病毒序列和2020年3月前在京流行的毒株、彼時在黑龍江和吉林流行的毒株都不一樣,卻和在國外,特別是在歐洲等地流行的毒株突變位點是相同的。這就說明這個毒株來自於境外。

  那麼怎麼從境外傳進來的呢?除了S14攤位,市場只有一個攤位也是售賣三文魚的,這個攤位沒有病例,而S14攤位是自己在市場內切割,其員工全部感染。且S14所賣的商品中只有三文魚是從境外進口的。

  為了進一步追溯感染的來源,我們對三文魚進行了檢測。S14在5月30日曾經購入了一家公司從境外進口的三文魚,但由於這批三文魚已經賣完,所以很遺憾,我們未能得到魚的樣本。但是我們從一份沒有開封的魚體表面,通過測序得到了覆蓋55%的基因組序列。通過比對發現這個序列,和我們前面在新發地測得的流行毒株的序列是一致的,也有這些相同的基因突變的位點。所以這就提示,儘管我們因為樣本原因沒有分離到這個病毒,無法證明它的感染性,但是可以提示進口的冷鏈食品可能是病毒的傳播載體。這也是第一次提出了這樣的一個發現。

  而市場內所有的三文魚的供應商倉庫的3000多份三文魚經過檢測後,有6份結果是陽性,而其中5份是來自X公司。隨後在國內多個地區也都發現在冷鏈食品表面檢測出新冠病毒核酸,並且中國疾控中心在青島在冷鏈食品的表面分離出新冠病毒。所以這也從另一個方面提示冷鏈食品在新冠病毒傳播中的重要性。

  通過疫情初期和北京這次小範圍疫情就能看出,基於宏□因組檢測技術對於病原的發現和溯源以及追蹤具有非常重要的作用。所以,未來要針對臨床和疾控的需求,使測序的速度更快、成本更低,通過自動化、智能化的技術,使它的使用更加便捷,而且能夠適應變異和耐藥分析等多樣化功能的需求,從而能實現走向普及應用,為隨時應對可能發生的疫情提供有力的支撐。

  註:本文根據王建偉教授在未來科學大獎周演講內容整理而來,有刪改。

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