《科學》:中德解析新冠主要蛋白酶晶體結構,有助抑製劑研發
2020年03月22日07:39

原標題:《科學》:中德解析新冠主要蛋白酶晶體結構,有助抑製劑研發

自新型冠狀病毒引起的疫情暴發以來,科學家們一直在努力尋找有效的病毒抑製劑。當地時間3月20日,頂級學術期刊《科學》在線發表了一篇題為“Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design of improved α-ketoamide inhibitors”的研究報告,科學家們用X射線以1.75埃解像度解析了新冠病毒Mpro的晶體結構。新冠病毒中的主要蛋白酶(Mpro,又稱為3CLpro)是一個重要的潛在藥物靶標,對抑製病毒的複製至關重要。

此外,該研究探討了一種α-酮酰胺抑製劑的作用。通過優化結構,研究人員將先導化合物開發成為SARS-CoV-2 Mpro的有效抑製劑。

優化抑製劑的藥代動力學特徵顯示出明顯的肺向性,並且適用於通過吸入途徑給藥

由於尚無具有類似裂解特異性的人蛋白酶,該抑製劑不太可能具有毒性。在新冠病毒仍在全球肆虐的當下,該研究有利於推動相關抑製劑的設計,促進治療方法的形成。

該文章的作者主要由德國科研團隊組成,包括德國呂貝克大學、德國漢諾威醫學院、柏林大學附屬夏里特醫院、馬爾堡大學、赫爾姆霍茲感染研究中心、中國長春吉大天元化學技術股份有限公司等,通訊作者為德國呂貝克大學生物化學研究所Rolf Hilgenfeld。

結構生物學家Rolf Hilgenfeld團隊自2002-2003年嚴重急性呼吸系統綜合徵(SARS)暴發以來,就一直在嚐試開發治療冠狀病毒的方法。當前,Hilgenfeld希望對新型冠狀病毒感染的動物進行兩種抑製劑化合物的測試,以期盡快開發出針對未來冠狀病毒暴發的治療方法。

新冠病毒是一種單鏈RNA正鏈包膜乙型冠狀病毒。與引起SARS(嚴重急性呼吸系統綜合症)和MERS(中東呼吸系統綜合症)的另兩種冠狀病毒類似,它的基因組編碼為非結構蛋白、結構蛋白和輔助蛋白。

非結構蛋白包括3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3-chymotrypsin-like protease,3CLpro)、木瓜蛋白酶樣蛋白酶(papain-like protease)、解旋酶(helicase)、和RNA依賴性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)。結構蛋白則包括刺突糖蛋白(spike glycoprotein)。

冠狀病毒中最具特徵的藥物靶標之一是上述的3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶,即主要蛋白酶(Mpro,也稱為3CLpro)。與木瓜蛋白酶一樣,這種酶在大型多蛋白1ab上的不少於11個切割位點上運行,對於加工從病毒RNA翻譯的多蛋白是必不可少的,因此,抑製這種酶的活性將阻止病毒複製。

此前,研究人員已經設計併合成了擬肽α-酮酰胺,作為β冠狀病毒和α冠狀病毒的主要蛋白酶以及腸病毒的3CLpro的廣譜抑製劑。

上述抑製劑化合物對MERS-CoV中東呼吸系統綜合徵冠狀病毒、SARS-CoV(嚴重急性呼吸系統綜合徵冠狀病毒)和腸道病毒均具有抗病毒作用,但其活性似乎在很大程度上取決於實驗中使用的細胞類型。

為了優化它以延長化合物在血漿中的半衰期,研究人員將P3-P2酰胺鍵隱藏在吡啶酮環中,修飾了現有的化合物11r(上圖中綠色圓圈),以期這能夠阻止細胞蛋白酶接近該鍵並使其裂解。

此外,為增加化合物在血漿中的溶解度並減少其與血漿蛋白的結合阻力,研究人員用疏水性稍差的Boc基團代替了疏水的肉桂酰基部分,得到13a這種化合物(上圖中的紅色圓圈)。

為了檢查13a中引入的吡啶酮環是否與靶標的三維結構兼容,研究人員確定了SARS-CoV-2主要蛋白酶的晶體結構(解像度為1.75Å)。

兩種不同視圖下SARS-CoV-2 主要蛋白酶的三維結構

研究人員發現,新冠病毒主要蛋白酶的三維結構與SARS-CoV主要蛋白酶的三維結構高度相似,序列同一性達96%。

其中,胰凝乳蛋白酶和小核糖核酸病毒3C蛋白酶樣結構域I和II形成六鏈反平行β桶,在它們之間帶有底物結合位點。結構域III是五個螺旋的球形簇,主要通過2個前體間鹽橋相互作用參與調節Mpro的二聚化。

SARS-CoV-2的Mpro形成的緊密二聚體具有一個接觸界面,主要位於分子A的結構域II與分子B的NH2末端殘之間。

研究人員使用蛋白酶的晶體結構來對接α-酮酰胺抑製劑13a。他們發現,與11r相比,13a在小鼠中的血漿半衰期增加了約3倍(從0.3小時到1.0小時),體外動力學血漿溶解度提高了約19倍,同時熱動力學溶解度提高了約13倍。但是,與11r相比,結構的調整導致其對SARS-CoV-2主要蛋白酶和腸病毒3C蛋白酶的抑製活性有所減少。

事實上,包括新冠病毒在內的β冠狀病毒Mpro的S2口袋具有顯著的可塑性,使其能夠“狡猾”地適應較小抑製劑的形狀。因此為了增強針對進化枝b的β冠狀病毒的抗病毒活性,

研究人員犧牲了抑製劑廣譜活性的目標,用較小的環丙基取代了13a的P2環己基部分,得到化合物13b

(本文圖1中的藍色圓圈)。

α-酮酰胺13b與SARS-CoV-2的Mpro的復合物X射線晶體結構,兩種解像度分別為1.95Å和2.20Å

研究人員使用20 mg / kg的劑量對小鼠進行皮下途徑的藥代動力學研究發現,化合物13a在小鼠血漿中的平均停留時間為約1.6小時,停留時間最多為約4小時,通過尿液排出的時間最多為24小時。血管外給藥後藥物在血漿中的最高濃度值(峰濃度,Cmax)為334.5ng/mL。

儘管13a從血漿中消失的速度非常快,但24小時後它在肺中的濃度為135ng/g,在小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的濃度為52.7ng/mL,這表明它已經被組織吸收。

接下來,研究人員對13b的有效性進行了測試,他們發現,13b與人血漿蛋白的結合度達到90%。

同樣對小鼠進行皮下注射時,研究人員用了更少的劑量(3 mg/kg),發現13b的Cmax為126.2 ng / mL,這大約是13a的峰濃度值的37%,但所用的化合物劑量大約降低了7倍。

同時,

13b在血漿中的平均停留時間延長至2.7小時,半衰期約為1.8小時。與13a相比,13b在血漿中的清除速度較慢

研究人員發現,4小時後,13b在小鼠肺組織中濃度仍達到約13ng/g。由於新冠病毒疾病對肺部有較大影響,13a和13b體現出的這種肺向性是有益的。

除皮下給藥外,研究人員還使用吸入裝置以3mg/kg對小鼠進行了霧化13b給藥。 24小時後,小鼠肺組織中存在13b的濃度為33ng/g。

小鼠對於抑製劑的吸入耐受良好,未顯示任何不良反應,研究者們認為這表明將該化合物直接施用於肺部是可能的

作者們最後寫道,鑒於這些有利的藥代動力學結果,此次研究為含吡啶酮的抗冠狀病毒藥物研發提供了有用的框架。

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